Tahap protein kemurnian sing dibutuhake gumantung marang tujuan pungkasan saka protein.
Kanggo sawetara aplikasi, ekstrak crude cukup. Nanging, kanggo kegunaan liyane, kayata ing panganan lan obat-obatan, tingkat kemurnian sing dhuwur kudu. Kanggo nggayuh iki, sawetara metode pemurnian protein biasane digunakake, ing serangkaian langkah-langkah pemurnian.
Saben langkah pemurnian protein biasane nyebabake sawetara mundhut produk. Mulane, strategi pemurnian protein sing ideal yaiku siji-sijine tingkat pambesaran paling dhuwur sing ditemokake ing langkah paling cilik. Pilihan saka langkah-langkah sing digunakake gumantung ing ukuran, daya, kelarutan lan sifat liyane saka protein target. Teknik-teknik ing ngisor iki paling cocok kanggo ngresiki protein sitosol tunggal. Pemurnian kompleks protein sitosolik luwih rumit lan biasane mbutuhake cara sing beda kanggo diterapake.
Langkah-langkah pisanan kanggo Pemurnian Protein
Langkah pisanan ngresiki protèin sel (njero sel) yaiku nyiapake ekstrak crude .
Ekstrak bakal ngandhut campuran komplek kabeh protein saka sitoplasma sel, lan sawetara makromolekul tambahan, kofaktor, lan gizi. Ekstrak mentah bisa digunakake kanggo sawetara aplikasi ing bioteknologi, ananging yen kemurnian iku sawijining masalah, langkah-langkah dimurnikan kudu dilacak.
Ekstrak protein kasar disusun kanthi mbusak puing-puing sel sing didadekake dening lysis sel, sing ditindakake nggunakake bahan kimia lan enzim , sonication utawa French Press. Lebu dibusak dening centrifugation, lan supernatant kasebut bakal pulih. Preparasi kasar protèin ekstrasèl bisa didapat kanthi cara ngangkat sel-sel kanthi sentrifugasi.
Kanggo aplikasi bioteknologi tartamtu, ana tuntutan kanggo enzim termostable : Enzim sing bisa ngidinake suhu dhuwur tanpa denaturing, lan nalika njaga aktivitas spesifik sing dhuwur. Organisme sing ngasilake kasebut asring disebut extremophiles. Cara sing gampang kanggo ngresiki protein sing tahan panas yaiku denning protèin-protèin ing campuran sajroné pemanasan, banjur ningkataké larutan (saéngga bisa mbeneraké enzim termostable utawa redissolve, yen perlu.) Protein denatured bisa dibusak dening centrifugation.
Langkah-langkah Purifikasi
Sadurungé, langkah kapindho sing umum kanggo ngresiki protein saka ekstrak crude yaiku kanthi presipitasi ing larutan kanthi kekuatan osmotik dhuwur (yaiku larutan uyah). Asam nukleat ing ekstrak crude bisa dibuang kanthi precipitating agregat sing dibentuk karo streptomycin sulfate utawa protamin sulfat.
Presipitasi protein biasane rampung nggunakake amonium sulfat minangka uyah.
Protein sing beda bakal nyegah ing konsentrasi amonium sulfat sing beda. Umumé, protèin bobot molekul sing luwih dhuwur nempuh ing konsentrasi rendah amonium sulfat. Presipitasi uyah ora biasane nyebabake protèin sing wis dimurnèkaké, nanging bisa mbantu ngilangi protèin sing ora disengaja ing campuran lan konsentrasi sampel. Garam ing larutan kasebut banjur dibuang dening dialisis liwat tabung selulosa keropos, filtrasi, utawa kromatografi eksisi gel.
Protokol bioteknologi modern kerep njupuk keuntungan saka akeh kit sing kasedhiya kanthi komersial sing nyedhiyakake solusi siap kanggo prosedur standar. Pemurnian protein sering dilakoni kanthi nggunakake saringan lan kolom filtrasi gel sing disiapake. Sampeyan kabeh kudu ngetutake pandhuan lan nambahake volume sing bener saka solusi sing bener lan ngenteni wektu sing ditemtokake nalika ngumpulake eluant (apa sing metu saka kolom liyane) ing tabung uji seger.
- Cara kromatografi bisa diterapake nggunakake kolom bench-top utawa peralatan HPLC otomatis. Pemisahan dening HPLC bisa ditindakake kanthi metode reverse-phase, ion-exchange utawa ukuran-eksklusi, lan conto-conto sing dideteksi dening array dioda utawa teknologi laser. Gg
Visualisasi dan Penilaian Protein Pemurnian
- Kromatografi fase mundur (RPC) misahake protein sing adhedhasar hidrophobisitas sing relatif. Teknik iki arang banget nanging mbutuhake pelarut organik. Sawetara protèin wis digawé permanen kanthi pelarut lan bakal ilang fungsi nalika RPC. Mulane cara iki ora dianjurake kanggo kabeh aplikasi, utamané yen perlu kanggo protein target kanggo nyegah kegiatan.
- Kromatografi ion-ijolan nuduhake pamisahan protèin adhedhasar pangisian daya . Kolom bisa disiapake kanggo ijol-ijolan anion utawa ijol-ijolan kation. Kolom ijol-ijolan anion ngemot fase stasioner kanthi muatan positif sing narik kawigaten protein-protein bermuatan negatif. Kolom ijol-ijolan kation iku manik-manik sing kuwat, sing ngalangi protein sing positif. Elusi protèin target ditindakaké kanthi ngganti pH ing kolom, sing ngasilaké owah-owahan utawa netralisasi gugus fungsi sing berisi saben protein.
- Kromatografi kromatografi kothak-ukuran ( filtrasi gel ) misahaké protein sing luwih gedhe saka sing cilik amarga molekul sing luwih gedhé luwih cepet nyalurake liwat polimer silang salib ing kolom kromatografi. Protein gedhe ora cocog karo pori-pori polimer, nanging protèin cilik ora bisa mlaku liwat kolom kromatografi, liwat rute kurang langsung. Eluate diklumpukake sajroning seri tabung sing misahake protein sing adhedhasar wektu elusi. Filtrasi gel minangka alat sing migunani kanggo konsentrasi sampel protein amarga protein target dikumpulake ing volume elusi sing luwih cilik tinimbang ing wiwitan ditambahake ing kolom. Tèknik filtrasi sing padha bisa uga dipigunakaké sajrone prodhuksi protein kanthi ukuran gedhene amergo efektifitas biaya.
- Kromatografi kesuburan minangka teknik sing migunani banget kanggo "polesan" utawa ngrampungake proses pemurnian protein. Manuk ing kolom kromatografi disambung menyang ligan sing ngiket khusus karo protein target. Protein kasebut banjur dibusak saka kolom kanthi mbilas karo solusi sing ngandung ligan bébas. Cara iki menehi asil sing murni lan aktivitas spesifik paling dhuwur dibandhingake teknik liya.
- SDS-PAGE yaiku elektroforesis gel polyacrylamide, sing ditindakake ing SDS (sodium dodecyl sulfate) sing ngubungake protein sing menehi daya negatif sing gedhe. Amarga biaya kabeh protèin sacara adil, metode iki misahaké meh kabeh miturut ukuran. SDS-PAGE asring digunakake kanggo nguji kemurnian protein sawise saben langkah ing seri. Minangka protèin sing ora dikarepake dibuang saka campuran, jumlah band sing digambarake ing gel SDS-PAGE wis suda, nganti mung siji band sing ngasilake protein sing dikarepake.
- Immunoblotting minangka teknik visualisasi protein sing diterapake kanthi kombinasi kromatografi afinitas. Antibodi kanggo protein spesifik digunakake minangka ligan ing kolom kromatografi afinitas. Protein target disimpen ing kolom, banjur dibusak kanthi mbilas kolom kanthi solusi uyah utawa agen liyane. Antibodi sing disambungake karo label radioaktif utawa dye kanggo mbantu ngetokake protein target sakwise dipisahake saka sisa campuran.
Sumber:
Zubay G. 1988. Biokimia, Edisi 2. Macmillan Publishing Co., New York, NY, Amerika Serikat.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.