Pangaturan ing salah sawijining komponèn reaksi Polymerase Chain Reaction (PCR) bisa ngowahi kualitas hasil, kanthi nambah utawa ngurangi prodhuk lan kualitas produk utawa kanthi ningkatake kekhasan reaksi lan sensitivitas. Parameter sing ngasilake asil pungkasan bisa dadi fisik (ie, suhu, wektu siklus) utawa kimia (ie, konsentrasi cithakan, jinis enzim sing digunakake). Ing ngisor iki ana sawetara faktor kunci sing ngasilake sukses PCR.
Kondisi Laboratorium Bersih
Awit PCR saged ndeteksi molekul DNA siji, penting kanggo njaga kondisi murni ing laboratorium. Tansah sarung tangan kanthi seger, gunakake gelas steril, pipo lan tips pipette lan solusi sing resik, lan ngresiki wilayah kerja sadurunge mulai kerja.
Tansah kalebu reaksi kontrol, tanpa cithakan DNA lan tanpa enzim, kanggo mesthekake asil sing saestu amergo amplifikasi sampel sing bener.
Paling wong kudu nggawe solusi dhewe sing ora dienggo bareng kanggo nggawe solusi sing luwih gampang lan ditrapake asring disisihake kanggo PCR wae. DNase lan RNase-free PCR tabung, tips pipet aerosol-tips lan digunakake ing hood fume karo lampu UV uga cara kanggo nyuda masalah.
02 Komponen Kimia
- Duwe 18 nganti 24 basis
- Ora duwe struktur sekunder (ie, puteran rambut)
- Nduwe distribusi seimbang saka pasangan G / C lan A / T
- Ora komplikasi kanggo saben liyane ing pucuke 3 kaki
- Suhu lebur (Tm) kira-kira 5-10 derajat Celcius ing sangisore suhu anane, sing biasane antara 55 derajat 65 derajat Celsius
Tm kanggo loro primèr uga padha kanggo asil paling apik.
03 Reaksi Campuran: Template lan Primer
Konsentrasi primer optimum antara 0,1 lan 0,6 micromol / L. Jumlah cithakan beda-beda gumantung saka jinis DNA (manungsa, bakteri, plasmid).
Kanthi jumlah template sing rada kurang, ana strategi liya kanggo nambah asil, kaya nomer siklus tambah utawa panggunaan "wiwitan panas." Tansah nyoba primers anyar kanthi reaksi kontrol positif, kanggo mesthekake yen ana ing kondisi eksperimen sing spesifik.
04 Reaksi Campuran: Enzim Kegiatan
Konsentrasi MgCl2 ing campuran reaksi bisa ngasilake asil PCR lan bisa muter peran penting ing reaksi sing luwih cepet. Kation magnesium bentuk kompleks larut dengan dNTPs untuk menghasilkan substrat nyata yang diakui enzim polimerase.
Jumlah total papat dNTP uga bisa ngurangi tingkat kesalahan polimerase. Aditif tartamtu kayata betaine, BSA, deterjen, DMSO, gliserol, lan pyrophosphatase uga bisa ndadekake kekiyatan enzim utawa efisiensi reaksi.
05 Tipe Thermocycler
Nalika mbuwang peralatan laboratorium, ngelingi manawa sawetara thermocycler kurang tepat tinimbang liya ing njaga suhu, sing dikarepake.
Iki minangka salah siji wilayah sing arep murah ora bakal mlayu ing wektu sing luwih dawa nalika sampeyan ngadhepi reaksi finicky utawa nggunakake primèr sing mbutuhake sawetara suhu annealing sing cetha.
Tabung reaksi berdinding nipis sing dirancang kanggo cocog karo identifikasi termokikler sing sampeyan gunakake, uga mbantu ngoptimalake suhu reaksi.
06 Setelan Siklus
Peningkatan panenan bisa diraih kanthi nambahake wektu extension babagan saben siklus 20, kanggo menehi ganti rugi enzim kurang kanggo nggedhekake cithakan liyane. Biasane, kurang saka 40 siklus cukup kanggo nggedhekake kurang saka 10 molekul cithakan kanthi konsentrasi cukup gedhe kanggo ndeleng gel katoda etidium bromide.