DNA urutan uga gumantung saka kemampuan kita nggunakake elektroforesis gel kanggo misahake untu DNA sing beda-beda ing ukuran kanthi sethithik minangka pasangan basa.
DNA Sequencing
Ing pungkasan taun 1970-an, teknik DNA urutaning urutan kanggo molekul DNA maneh wis diciptakake. Iki minangka metode Sanger (utawa dideoxy) lan metode Maxam-Gilbert (cleavage kimia). Metode Maxam-Gilbert adhedhasar pemecahan khusus nukleotida dening bahan kimia lan paling apik digunakake kanggo ngurutake oligonukleotida (polimer nukleotida sithik, biasane luwih cilik tinimbang 50 pasangan basa sing dawa). Cara Sanger luwih umum digunakake amarga wis bukti teknis luwih gampang kanggo aplikasi, lan, karo tekane PCR lan otomatisasi teknik, gampang Applied menyang dawa lembaran DNA kalebu sawetara gen kabeh. Teknik iki adhedhasar terminasi rantai dening dideoxynucleotides sajrone reaksi elongasi PCR.
Sanger Method
Ing metode Sanger, untaian DNA sing bakal dianalisis digunakake minangka cithakan lan polimerase DNA digunakake, ing reaksi PCR, kanggo ngasilake lembaran tambahan nggunakake primèr.
Papat beda campuran reaksi PCR disiapake, saben duwe persentase tartamtu saka analog dideoxynucleoside trifosfat (ddNTP) kanggo siji saka papat nukleotida (ATP, CTP, GTP utawa TTP). Sintesis saka untai DNA anyar tetep dumadi nganti salah sawijining analog kasebut digabung, ing wektu iki untu diwiwiti kanthi premati.
Saben reaksi PCR bakal rampung sing ngandhut campuran beda DNA lembaran, kabeh diakhiri karo nukleotida sing dideoxy dilabel reaksi kasebut. Gel electrophoresis banjur digunakake kanggo misahake helai saka reaksi papat, ing papat lintang sing kapisah, lan nemtokake urutan cithakan asli adhedhasar dawane endhas ending karo nukleotida.
Ing réaksi Sanger otomatis, primèr digunakake sing dilabeli kanthi 4 werna neon sing beda-beda. Reaksi PCR, ing sajrone nukleotida dideoxy sing beda, ditindakake kaya sing kasebut ing ndhuwur. Nanging, sabanjure, campuran reaksi papat kasebut banjur digabungake lan ditrapake ing siji jalur gel. Warna saben pecahan dideteksi nganggo sinar laser lan informasi dikumpulake dening komputer sing ngasilake kromatograms sing nuduhake puncak kanggo saben werna, saka ngendi urutan DNA cithakan bisa ditemtokake.
Biasane, cara sekuen otomatis mung akurat kanggo sekuen nganti maksimal watara 700-800 pasang pasangan. Nanging, bisa diwenehi urutan lengkap gen sing gedhé lan, ing kasunyatan, kabèh genom, kanthi nggunakake cara sing sepi banget kayadéné urutan pramuka Primer Walking lan Shotgun.
Ing Primer Walking , bagean sing bisa ditrapake ing gene sing luwih gedhe diisi kanthi cara Sanger. Primer anyar diasilake saka bagean sing dipercaya saka urutan kasebut lan digunakake kanggo nerusake urutan bagean saka gen sing metu saka reaksi asli.
Urutan sekuritisasi nyakup acak kanthi cara motong segmen DNA dadi fragmen ukuran sing luwih cocok (bisa dikelola), ngurut urutan saben fragmen, lan ngorganisasi potongan-potongan kasebut miturut urutan sing tumpang tindih. Teknik iki wis digawe gampang dening aplikasi piranti lunak komputer kanggo ngatur bageyan sing tumpang tindih.