Apa PCR Apa Apa Kanggo Nggawe Gen DNA lan Gen?
Reaksi polimerase ( PCR ) yaiku teknik genetik molekuler kanggo nggawe salinan pirang-pirang gene lan uga minangka bagean saka proses urutan gen.
Carane Reaksi Chain Polymerase Bisa Nggawe?
Salinan gene digawe nggunakake sampel DNA, lan teknologi cukup becik kanggo nggawe salinan sawetara saka siji salinan gen sing ditemokake ing sampel. PCR amplifikasi gen kanggo nggawe mayuta-yuta salinan, ngidini kanggo nemtokake lan ngenali urutan gen nggunakake teknik visual sing adhedhasar ukuran lan daya (+ utawa -) saka potongan DNA.
Ing kahanan sing dikontrol, segmen cilik saka DNA bakal diasilake dening enzim sing dikenal minangka polimerase DNA, sing nambahake deoxynucleotides (dNTPs) kanggo bagean saka DNA sing dikenal minangka "template." Malah potongan DNA sing luwih cilik, disebut "primers" digunakake minangka titik wiwitan kanggo polimerase. Primer yaiku potongan DNA cilik (oligomer), biasane antarane 15 lan 30 nukleotida sing dawa. Iki digawe kanthi ngerti utawa ngira urutan DNA cendhak ing pungkasan banget gen sing digedhekake. Sajrone PCR, DNA sing dipisahake dipanasake lan garis-garis ganda kapisah. Sawise cooling, primers nyantol karo template (disebut annealing) lan nggawe panggonan kanggo polimerase kanggo miwiti.
Teknik PCR
Polimerase polimerase (PCR) bisa digawe kanthi panemon thermofil lan enzim polimerase termofilik (enzim sing njaga integritas struktural lan fungsionalitas sawise dadi panas ing suhu dhuwur).
Langkah-langkah ing teknik PCR yaiku:
- A dicampur digawe, kanthi optimalisasi konsentrasi saka cithakan DNA, enzyme polimerase, primer, lan dNTPs. Kemampuan kanggo ngetokake campuran tanpa menehi enzim ngidini nyuda helix pindho sampel DNA ing suhu ing suhu 94 derajat Celcius.
- Sawise denaturation, sampel luwih disenengi karo sawetara sing luwih moderat, sekitar 54 derajat, sing ndadekake gampang anil (ngiket) primèr menyang templat DNA sing siji.
- Ing langkah katelu siklus, sampel dipanaskan nganti 72 derajat, suhu becik kanggo Taq DNA Polymerase, kanggo elongasi. Sajrone elongation, polimerase DNA nggunakake DNA tunggal sing asli minangka cithakan kanggo nambah dNTPs pelengkap menyang 3 'ends saka saben sepisanan lan ngasilake bagean DNA pindho dhobel ing wilayah gene kapentingan.
- Primer sing wis disambung karo urutan DNA sing ora cocog karo persis ora tetep annealed ing 72 derajat, saéngga mbatesi elongasi menyang gen sing kapentingan.
Proses penyajian, annealing lan elongasi iki diulang kaping pirang-pirang (30-40), kanthi mangkono nambah akeh salinan saka gene sing dikarepake ing campuran kasebut. Sanajan proses iki bakal cukup nyenengake yen ditindakake kanthi manual, conto bisa disusun lan diinkubasi ing Thermocycler sing bisa diprogram, saiki umume ing laboratorium molekul sing paling akeh, lan reaksi PCR sing lengkap bisa ditindakake sajrone 3-4 jam.
Saben langkah penundaan mandhekake proses elongasi siklus sadurungé, saéngga ngurangi untu DNA sing anyar lan tetep nganti kira-kira ukuran gene sing dikarepake.
Sabanjure siklus elongasi bisa digawe luwih dawa utawa luwih cendhek gumantung saka ukuran gen sing kapentingan, nanging pungkasane, liwat siklus PCR bola-bali, mayoritas template bakal diwatesi kanthi ukuran gen mungane, amarga bakal wis digawe saka produk saka loro primers.
Ana sawetara faktor sing beda kanggo PCR sukses sing bisa dimanipulasi kanggo nambah asil. Cara sing paling akeh digunakake kanggo nguji ngarsane produk PCR yaiku elektroforesis gel agarosa . Kang digunakake kanggo misahake potongan DNA adhedhasar ukuran lan biaya. Potongan kasebut banjur digambarake nggunakake pewarna utawa radioisotop.
Evolusi
Wiwit panemuan PCR, polimerase DNA liyane tinimbang Taq asli wis ditemokake. Sawetara iki duwe kemampuan "proofreading" sing luwih apik utawa luwih stabil ing suhu sing luwih dhuwur, saéngga ningkatake kekhususan PCR lan ngurangi kasalahan saka panyabutan dNTP sing ora bener.
Sawetara variasi PCR wis dirancang kanggo aplikasi spesifik lan saiki digunakake kanthi tetep ing laboratorium genetik molekuler. Sawetara iki minangka PCR Real-Time lan Reverse-Transcriptase PCR. Panemuan PCR uga nyebabake pangembangan DNA urutan, fingerprinting DNA lan teknik molekuler liyane.